张济培，陈济铛，陈建红，司兴奎, 

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院动物医学系，广东佛山  528231）

摘要：本文就红细胞凝集(HA)与红细胞凝集抑制(HI) 试验（微量法)在家禽新城疫等疫病免疫监测中应用的实验课教学的若干方面，包括课程题目、教学目的、教学内容、实验用材、操作关键、结果判断、误差规避、指导接种、时间安排等等，谈谈自己多年来教改的探讨、体会，以期达到改善本实验课程教学效果，提高教学效率，贴近生产实际，加强生产指导作用等目的。

关键词：鸡新城疫，免疫监测，实验课，教改，学周刊

Study on the Application of HA / HI Test in Poultry Immunosurveillance

Zhang Jipei, Chen Jidang, Chen Jianhong, Si Xingkui,

(Department of Animal Medicine, College of Life Sciences and Engineering, Foshan Institute of Science and Technology, Foshan, Guangdong, 528231)

Abstract: this paper deals with several aspects of experimental teaching in the application of hemagglutination (HA) and hemagglutination inhibition (HI) test (micro method) to the immune monitoring of epidemic diseases such as Newcastle disease in poultry, including course title, teaching purpose, teaching content, and so on. Experiment material, operation key, result judgment, error evading, instruction inoculation, time arrangement, etc., this paper discusses the discussion and experience of teaching reform in the past years, in order to improve the teaching effect and improve teaching efficiency of this experiment course. Close to the reality of production, strengthen the role of production guidance and other purposes.

Key words: Newcastle disease, immune surveillance, experimental class, teaching reform

我国严重危害家禽健康且病原具有血凝性的病毒性传染病，在上世纪80年代初期之前，主要是鸡新城疫^[1]；80年代中期至90年代初期增加了鸽瘟（又称鸽新城疫，鸽I型副粘病毒病）、产蛋下降综合征、H9亚型禽流感等^[2,3,]，90年代中期之后，再增加了H5亚型禽流感、H7亚型禽流感等和水禽新城疫（也有称水禽副粘病毒病，鹅副粘病毒病，鸭副粘病毒病）。防控上述疫病的关键方法之一是，实施特异免疫接种和免疫监控。而监控免疫效果的有效方法是HA (红细胞凝集)与HI(红细胞凝集抑制)试验。HA与HI技术对于正确指导禽群的鸡新城疫、鸽瘟、禽流感、产蛋下降综合征等重要疫病的常规免疫接种、加强接种和紧急接种具有重要的作用。笔者经常进行本技术的实验课教学，并不断在解决教学难点、疑点，改善教学效果、提高教学效率、贴近生产实际、加强生产指导作用等方面进行思考，积累了一些心得，谨陈述如下，以供参考。

1 关于本实验课的题目

病原具有血凝性的家禽病毒性传染病，除鸡新城疫，尚有鸽瘟、水禽新城疫、禽流感和产蛋下降综合征等。上述各种传染病均可应用HI试验（微量法）进行免疫监测，实验术式大同小异。2004年以前，本校在进行鸡新城疫免疫监测实验课教学过程，穿插提及鸽瘟、水禽新城疫、禽流感和产蛋下降综合征等的免疫监测要点。2005年以后，本校禽病学实验教学大纲将“鸡新城疫免疫监测”课题名称改为“禽具血凝性病毒病的免疫监测—以新城疫免疫监测为例”，同时在实验指导书中的必要环节，提示各种疫病免疫监测技术的不同要点，

以期提高本实验课的信息容量。实验课题作了上述修改后，在实验课开始时，要着意解题，讲明何谓免疫监测，具血凝性病毒病主要包括哪些，本试验以何种病的免疫监测为例等，以引起学生的注意。

2  关于本实验课目的要求

本实验课的目的与要求，通常只着重于“掌握鸡新城疫免疫监测的方法—红细胞凝集试验与红细胞凝集抑制试验”，这样对于学生在兽医专业基础课上已学过的“红细胞凝集试验与红细胞凝集抑制试验”知识，未能给以明显的提升、发展。实践证明，仅掌握红细胞凝集试验与红细胞凝集抑制试验，尚远远不能满足鸡新城疫等疫病免疫监测的目的。对于即将进入禽病防治一线工作的学生，还应能依据免疫监测的结果分析禽群目前的免疫状况，指导相应禽群实施进一步的免疫接种。故在本实验课的具体指导过程中和实验指导书内容中，都应注意让学生将“依据血凝性病毒病免疫监测的结果指导禽群相应病毒病的免疫接种”作为本实验课的重要目的之一。

3  关于实验原理

充分了解实验原理，对于掌控实验整体，把握实验关键，较高质量地完成实验内容具有重要的作用。以往，笔者考虑到兽医专业学生前期曾在微生物学课程学习过HA/HI反应原理，故在上本实验课时，仅仅简单带领学生重温一下：“血凝性病毒具有凝集红细胞的能力，且该能力可以被特异抗体所抑制”。 后来发现，大多数学生对于该概念理解并不深刻，较难据此洞悉本实验的原理，不利于提高学生在实验操作过程的主动性，导致实验教学效果大打折扣。鉴此，在近几年的教学中，笔者设计并采用了如下的一个讲授方法：

1.提问学生：“血凝性病毒具有一个重要的生物学特性是什么？”引导学生回忆：“①该类病毒具有血凝特性，②该血凝性可被相应抗体所抑制”；

2.具体解释：上述“①”的含义和反应现象是： “如果在反应孔中依次加入血凝性病毒（抗原）和家禽红细胞，孔底将会出现凝集图像，读作‘凝集’，记作‘+’，此反应称为凝集反应(HA)”； 上述②的含义和反应现象是“反应孔中加入血凝性病毒（抗原）、相应血清（抗体）、家禽红细胞，孔底将会出现凝集抑制图像，读作‘凝集抑制’，记作‘-’，此反应称为凝集抑制反应（HI）”；

3.推进判断：将被检血清作凝集抑制试验，可以据反应结果图像确定其中是否含有相应的抗体（孔底图像为‘凝集’时，被检血清不含抗体；孔底图像为‘凝集抑制’时，被检血清含有相应抗体）。

4.拓展认识：在上述HI试验中，如果对被检血清不作稀释，则试验只可获得一个定性的结果（确定血清中有或无相应抗体）；如果对被检血清作一系列的倍比稀释，对每一个稀释度的血清作HI反应，则试验就可依据最终出现完全抑制反应的血清稀释度的高低情况，获得一个定量的结果（确定血清中相应抗体有多少个㏒2）。

经过上述方法对试验原理作讲解，绝大部分学生可以非常清楚的了解具血凝性病毒病免疫监测技术的实验依据、基本过程及反应结果判定、记录的基本方法等，明显提高了学生学习本技术的主动性和学习效率。

鉴于实验课程不允许花费过多的时间讲授，笔者对上述讲授内容制作了简明的PPT，使讲授可控制在5分钟之内完成。如将本内容前置于禽病学理论课中相关疫病（如新城疫）的诊断内容中，加以扼要陈述，实验课中再复习一下，效果会更好。

4  关于实验用材

教师在实验示范开始时，扼要、有序地介绍关键用材，有助于帮助学生对较复杂的实验程序强化印象。在本实验中，以新城疫免疫监测为例，介绍试验用材时，一方面，要让学生注意新城疫免疫监测所需的具体用材有哪些；另一方面，要让学生注意不同的疫病，需采用哪些不同的用材。在介绍抗原时，要强调抗原必须为具有4个凝集单位的抗原。抗原凝集单位过高过低都会明显影响抗体的检测结果。对于准确配制4个凝集单位的抗原的术式，应强调的关键包括：精确地实施HA试验操作；准确地判读HA试验结果；依据HA试验结果，准确计算和量取抗原原液及稀释液将抗原原液稀释为4个凝集单位的抗原液；正确地对初配的4个凝集单位的抗原液作滴定检测和必要的矫正。对于红细胞悬浮液的配制，操作程序不算复杂，一般无大问题，要强调的是，离心洗涤红细胞的时间、速度标准化，吸取红细胞沉淀物溶积要准确，水禽的免疫监测试验（即对白鸭、番鸭、鹅的血清检测）应采用同种的成年动物的红细胞（或为减少制备红细胞种类，检测水禽血清时一般可通用成年番鸭的红细胞）配制1%的红细胞悬浮液。还要指出被检血清的采集时机、方法和比例。

5  关于HI试验操作   

这是本实验课的实操重点。教师应当做一个精确到位的示范，并设法让学生高度集中注意力观察示范；

HI实操环节常出现的问题：一是学生总感觉此操作较复杂，二是学生总会出现加样出错情况。据此，教师示范前先将HI试验程序归纳为七步骤：（1）分装稀释液；（2）加入被检血清；（3）稀释血清；（4）加入4单位抗原；（5）加入红细胞；（6）静置感作；（7）判断结果。示范过程，对每一个步骤边示范边强调1-2个关键点（学生易出错点）。如分装稀释液注意最后一孔与前面各孔容量不同；被检血清只加入第一孔；稀释血清要统一吹打次数和移液准确性，最后二孔留作对照孔；最后一孔不加抗原，等等；示范结束时，让学生共同回顾一次“七步骤”，旋即开始实操。这样，基本上能保证95%以上的学生正确完成操作。HI试验结果的判断，也是完成本实验的重中之重。如果不注意指导方法，也会使较大比例的学生出现误判错判的情况。依据多年的教学经验，笔者总结了结果判断的示教要点如下：(1)首先要学生掌握好反应结果判断的基本时间，即以抗原对照孔和PBS对照孔反应的情况做标准，当PBS对照孔的红细胞完全沉降到孔中央，且反应孔中的液体清亮时，为最佳反应时间，即为判定反应的终点时间；（2）以PBS对照孔的红细胞的流淌程度为依据，凡是与PBS对照孔的红细胞流淌情况一致的抗体检测孔均判定为完全抑制孔；（3）要求学生逐一记录抗体检测孔的反应图像；（4）根据抗体检测孔反应系列图像，找出完全抑制的最高血清稀释度孔，以该孔血清稀释度作为该血清的HI效价，写出HI效价；（5）教师逐个检查学生的试验结果，特别是让学生指出HI反应的终点孔，并读出HI效价。

6  关于实验误差规避

    应用HI试验进行具血凝性病毒病的免疫监测，导致误差的因素较多，在示教、示范过程和学生操作过程中，教师要做到心中有数，重点强调规避。除上述提及的一些操作要点外，尚需特别注意的环节有：正确使用移液器，滴管与移液器紧密接合，每次移液量尽可能准确；作抗体的稀释吹打过程，力度要平稳，每孔样品吹打稀释次数一致； 4单位凝集抗原配制，必须进行滴定试验，完全凝集孔要出现在第二孔等等。

7  关于指导鸡群接种

    当学生正确掌握了HI试验方法，并取得检测结果后，教学的重点要转入到如何依据HI试验结果指导被检禽群免疫工作上。一是要正确引导学生讨论鸡群抗体临界滴度的概念，确定科学的临界滴度；二是让学生理解鸡群抗体合格率的计算公式和计算方法；三是让学生理解和掌握不同日龄鸡群免疫合格的标准；四是指导学生以免疫检测的结果和免疫合格标准为主要依据，同时结合鸡群其他情况，如相关免疫的时间间隔、鸡群健康状况、疫病流行动态等等，对鸡群的进一步免疫接种提出合理的意见^[10]。

8  时间与程序安排

本实验课内容较多，时间较紧，要比较合理地安排课程内容，穿插安排示教、示范、学生操作，讨论等程序。本实验课一般可安排2-3个课时。安排2学时时，4单位凝集抗原和红细胞悬浮液均应预先配备。教学过程可安排为：（1）教师简单解题和指出目的内容，确切说明原理；（2）扼要示范，点明用材，强调实验程序和操作注意事项；（3）在教师的巡视下，学生操作至抗原抗体感作步骤；（4）利用抗原抗体感作时间，教师具体指导结果判定记录方法和禽群免疫指导的方法；（5）学生判定记录结果；教师对学生实验结果及判断记录逐一作确认；（6）师生共同依据免疫监测结果讨论指导禽群免疫接种的方法；（7）实验课小结，指出实验存在问题，布置实验报告作业，强调实验报告写作的注意事项。为了简明扼要，节约时间，对于实验原理、4单位凝集抗原制备、红细胞悬浮液配备、实验结果的判定方法、禽群免疫合格率计算与免疫指导方法讨论等环节，都建议制备和使用合适的PPT辅助示教。

9  关于作业批改要点

    就课堂教学而言，做好作业批改，是纠正学生技术错误，提高实验课效率的最后一个重要环节。多年来，我们发现学生发生率较高的错误点，包括：不如实陈述实验用材，误将HA程序误为HI程序，HI反应终点“图”“数”不一致（HI效价概念不清），鸡群抗体临界滴度概念错误，鸡群抗体合格率公式套用数据错误，实验报告格式欠规范等等，这些问题都被我们列为作业批改的主要关注点。

10  小结

“鸡新城疫免疫监测”实验课非常重要。适当修改课题和课程目的，内容上兼顾到几种相关传染病的免疫监测；注意实验用材、实验操作关键点和结果判断方法要点的教学指导、示范，注意讲清部分容易出现歧义的概念，规避歧义；避免易造成实验误差的各种因素；加强应用实验结果指导临床免疫方法的讨论、分析；精心穿插、安排教学过程中的各部分内容，提高教学效率；如此，将可进一步改善本实验课的教学质量，使之在鸡新城疫、鸽瘟、水禽新城疫、禽流感和产蛋下降综合征感染等传染病的免疫防控中发挥更多作用。不仅如此，由于本实验涉及众多兽医传统实验的基本技能，实际上是一个兽医实验综合技能训练的实验课程，因此，不断探索改进本课程的教学方法，对于强化兽医专业高年级学生兽医实验技能的综合应用能力，以及提高其学习应用现代兽医高新实验技术的能力，均有裨益，值得同行给以更多的注意和重视。

参考文献

[1]丁壮，尹仁福，薛聪，王建忠，钱晶. 新城疫流行病学新特点与鹅新城疫防控策略[J]. 中国兽医学报，2015，35（1）：159-168.

[2]熊永忠，王秀荣，曹殿军，刘培欣，张勇. 鸽源新城疫病毒的分离与鉴定[J]. 黑龙江畜牧兽医，2002,5：22.

[3]廖秀云，陶虹，邵建宏，罗宝正，薄清如，刘国昌，徐海聂，沙才华. 新型基因芯片检测禽流感病毒、新城疫病毒和鸡减蛋综合征病毒[J]. 动物医学进展，2013,34（10）：15-20.

文稿来源：教育教学论坛编辑部 网址：www.jyjxlt.com